生命学院姚骏课题组发现突触囊泡停泊初始态发生的过程及其分子机制
3月17日电 神经元之间的信号传递是大脑最基础的生理活动，当动作电位到达突触时，突触小泡在毫秒级的时间内释放神经递质，从而使动作电位快速跨突触传递，这一过程受到特定蛋白质机器的精密调控。突触小泡与质膜的融合可分为停泊（Docking）、点火（Priming）和融合（Fusion）三个过程。停泊作为囊泡融合的起始阶段，其重要意义在于大脑的神经活动并不是以单个的动作电位发生的，而是以十分高频率的一串动作电位的方式进行，这就要求突触有一批能快速释放的囊泡在时刻准备着。囊泡的即刻可释放池（RRP）保障了这一功能，并作为决定突触强度的首要因素，影响着神经元和大脑许多重要的功能，而停泊这一过程是囊泡进入即刻可释放池的初始步骤，其如何发生、由谁介导，目前尚无定论。
在文献报道中，Synaptotagmin-1 (Syt1)和三个SNARE蛋白形成的复合物，是介导突触小泡停泊的潜在候选分子机器。SNARE复合物由三个蛋白组成，是囊泡与质膜融合的最小蛋白机器。Syt1则是动作电位诱发突触小泡释放的钙离子感受器。在经典的囊泡融合模型中，三个SNARE蛋白在远端结合形成一个Z字型的拉链，随着4个平行α螺旋束结构的形成，囊泡自远而近地完成了停泊-点火（Docking-Priming）的过程，进入准备释放（release ready）的状态，这是囊泡停泊的传统模型，即SNARE complex介导了囊泡的停泊。然而，这一模型存在较大争议，原因在于两方面。一方面，停泊的形态学定义（即囊泡须紧贴于质膜）并不准确，停泊究竟在什么位置启动，一直是悬而未决的问题。另一方面，在蛋白机器研究上，多重基因敲除动物模型不但耗时耗力，而且存在很多发育缺陷与代偿作用带来的负面效应。
为解决上述技术障碍，姚骏课题组开发了在体高效沉默多重基因的CRISPRi技术，在神经元中，高效特异地对基因单独或者联合进行条件性敲低，在神经元内构建出类体外重构的环境。另外，课题组结合高压冷冻（High pressure freezing）与电子断层扫描（TEM tomography）技术，得到接近真实状态下神经元突触不同基因敲除的三维电镜数据。从而对突触小泡的停泊过程进行精确的电镜观测和定义。作者首先对SNARE复合物进行了多重敲低，发现在离突触前膜2-12 nm的范围内，突触小泡出现了数倍于对照组的聚集。在SNARE全敲的基础上引入Syt1敲低后，突触小泡的聚集现象消失，这说明Syt1可能是将囊泡圈定在2-12 nm范围内的关键因素。随后的一系列实验全面证实了Syt1的这一功能。进一步，作者们开始探索Syt1启动突触囊泡停泊的分子伴侣。脂质体共沉淀实验（co-sedimentation）表明，Syt1可以通过其C2B domain上的K325-K327模块与PIP2结合，突变这一模块（Syt1KA），Syt1则无法与PIP2相互作用。而Syt1与SNARE结合有两个界面，同时突变这些界面位点（Syt1Q/LLQQ），可以有效地减弱Syt1与SNARE的结合。作者发现，在Syt1/SNARE敲低组中引入Syt1KA突变体，并不能让突触小泡被圈定在2-12 nm范围内，而Syt1Q/LLQQ却可以执行这一功能。所以，Syt1很可能通过与PIP2结合来启动突触小泡停泊。针对PIP2的功能研究，作者们使用了四种不同的方法来降低或提升突触前膜上PIP2的含量，包括PIP2合成酶PIP5K三个亚型的三重敲降、PIP2水解酶Synaptojanin-1 (Synj)的增强型突变，以及代谢型谷氨酸受体mGluN5的拮抗剂和激动剂处理。这四种方法均有效地改变了突触前膜上PIP2的含量。此外，电镜分析结果表明，降低PIP2含量可抑制Syt1在2-12 nm处启动突触小泡的停泊，而提升PIP2含量则无明显效应。这一系列实验，证明了PIP2是Syt1在膜上的分子伴侣，它们相互作用、共同启动了突触小泡的Docking。
综合来看，本项研究发现Syt1结合PIP2介导了突触小泡的停泊的起始过程，其作用位置位于距质膜约12 nm处，该过程不依赖于SNARE复合物，且优先于SNARE复合物的形成。通过这一研究，作者们发现了Docking起始态发生的位置和分子机制，为理解神经递质的释放过程，尤其是理解大脑在受到高频生理刺激时神经元保持快速高效的响应，作出了重要贡献。
突触囊泡Docking的动态过程及其分子机制
此研究工作于3月16日在线发表于《细胞报道》（Cell Reports）期刊。清华大学生命学院姚骏研究员为本文的通讯作者。生命学院博士生陈运、王颖菡及生命学院已出站博士后郑毅为共同第一作者。清华大学生命学院李雪明研究员及其课题组李美静博士，姚骏课题组王秋文博士、博士生汪兵、付崇雷、刘要南为本项研究作出了重要贡献。清华大学冷冻电镜平台李英博士和胡晓风、细胞影像平台王文娟博士、NIBS何万中研究员和尼康公司李勋博士为本研究提供了重要帮助。
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